苏州大学刘庄/陈倩《ACS Nano》：蛋白药物口服递送新策略
由于各种肠道障碍，口服蛋白质药物一直具有挑战性。因为大分子药物口服生物利用度较差(<1%)，蛋白质药物必须克服胃肠道环境中的一系列生物障碍，包括生化障碍，如胃中极酸性的pH值(pH值1.0 - 2.0)和胃蛋白水解酶以及细胞屏障。
近日，苏州大学刘庄教授、陈倩教授团队开发了一种有效的口服蛋白质递送策略，利用两性离子原位聚合包封蛋白质，然后装入肠溶包衣胶囊进行口服。口服这种胶囊后，一旦胶囊进入肠道，肠道涂层将被降解，释放出聚两性离子/蛋白质纳米复合物。在聚两性离子修饰的帮助下，这种纳米复合物能够通过粘液和细胞屏障。采用这种策略，口服胰岛素和免疫球蛋白G (IgG)的生物利用度分别高达16.9%和12.5%。口服聚两性离子/胰岛素胶囊可有效降低糖尿病动物(小鼠、大鼠和猪)的血糖水平。此外，封装抗程序性死亡-1抗体 (αPD-1)的胶囊能诱导有效的抗肿瘤免疫反应。该工作提出了一种有效口服蛋白质药物的策略，包括那些使用现有技术很难口服的大分子量蛋白质药物(如抗体)。 相关论文以“ In Situ Polymerization of Zwitterions on Therapeutic Proteins to Enable Their Effective Oral Delivery ”为题，发表在《ACS Nano》上，第一作者为方华攀。
【文章要点】
一．两性离子包封蛋白的合成与表征
为了证实原位聚合后得到的聚两性离子能有效包封蛋白质药物，选择牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白。在BSA存在的情况下，两性离子单体进行原位自由基聚合。由于BSA表面电荷分布不均匀，30个带正电荷的M1或M5只能与蛋白质表面的负电荷区相互作用，而带负电荷的M2或M6只能与蛋白质表面的正电荷区相互作用，导致聚合物/蛋白质配合物缩合不良。由于所获得的聚合物中同时存在正电荷和负电荷， M4、M8和M9则能有效地装载和凝结BSA蛋白。为了进一步评估M8/BSA通过粘膜和细胞屏障的能力，对小鼠进行麻醉，并通过回肠注射聚合物/FITC-BSA复合物。2 h后对小鼠实施安乐死，收集小鼠小肠冷冻切片，用于共聚焦激光扫描显微镜成像。与其他聚合物/FITC-BSA复合物相比，M8/FITC-BSA复合物显示更有效地穿透肠粘膜。在transwell实验中，M8/FITC-BSA表现出比游离FITC-BSA和M4/FITC-BSA更有效的穿透。此外，在加入M8/BSA后，transwell系统中上下腔之间的电阻变化可以忽略不计，说明细胞单层中细胞间的紧密连接未被破坏。通过测量溶液中的荧光强度，发现肠溶胶囊在胃液中几乎不能降解，而在肠液中1 h内完全降解，说明肠溶胶囊能维持蛋白质药物在胃中的稳定性，促进蛋白质药物在肠道中的释放。
图1 聚两性离子有效地克服粘液和细胞屏障
二．M8/蛋白复合物通过PAT1通路穿过细胞屏障
PAT1在Caco-2细胞中过表达，因此评估了聚合物/BSA复合物在Caco-2细胞中的摄取效率。与游离相比，FITC-BSA和M4/FITC-BSA、M8/FITC-BSA被Caco-2细胞摄取增加。此外，一旦用PAT1抑制剂预处理Caco-2细胞，M8/FITC-BSA内吞效率降低。相反，3T3细胞中PAT1的表达较低，M8/FITC-BSA和M4/FITC-BSA在3T3细胞中具有相似的内吞效率。与FITC-BSA组和M4/FITC-BSA组相比，M8/FITC-BSA组表现出更高的荧光强度，这表明Caco-2细胞内化的M8/FITC-BSA可以更有效地由细胞胞吐排出体外。
图2 聚两性离子/蛋白质复合物通过PAT1通路穿过细胞屏障
三．M8/胰岛素胶囊显著降低糖尿病动物口服后的血糖水平
为了进一步探讨口服M8/蛋白胶囊后，作者选择胰岛素作为治疗蛋白。首先，在糖尿病大鼠中评估M8/胰岛素胶囊组的生物利用度。皮下注射胰岛素时，血清中胰岛素含量先升高后降低，在注射后1 h达到峰值。而口服游离胰岛素胶囊后，整个过程中血清胰岛素含量基本可以忽略不计。健康小鼠口服聚合物/ cy5.5 -胰岛素后，在不同时间点采集安乐死小鼠的胃肠组织进行体外荧光成像。各组中，游离胰岛素胶囊组小肠滞留和吸收最差，M8/胰岛素胶囊组最好。在包括大鼠和猪模型在内的大型糖尿病动物模型中，M8/胰岛素胶囊组在相同胰岛素剂量下表现出最佳的降糖效果，最低血糖值分别达到初始血糖水平的46.6%和50.6%，表明口服给药后血糖水平持续下降超过8小时。因此，口服后具有良好生物利用度的M8/胰岛素胶囊可对不同类型的患者有显著的降糖作用。
图3 M8/胰岛素肠溶胶囊口服后对糖尿病动物模型具有良好的降糖作用
四．M8/αPD-1胶囊可有效抑制肿瘤生长诱导抗肿瘤免疫响应
作者进一步使用M8包埋其他蛋白质药物，如口服治疗肿瘤的抗体。口服游离αPD-1胶囊几乎不能抑制肿瘤生长，而在相同剂量αPD-下，口服M4/αPD-1胶囊表现出中等的抗肿瘤效果，抑制肿瘤生长的比例为24.6%。口服M8/αPD-1胶囊的抗肿瘤作用明显强于游离αPD-1胶囊和M4/αPD-1胶囊，且对肿瘤生长有较高的抑制作用。M8/αPD-肿瘤组织中的CD8 +和CD4 +T细胞浸润水平显著高于PBS和αPD-1胶囊(口服)组。M8/αPD-1胶囊和αPD-1 (i.v.)组治疗的促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ)水平显著升高，TGF-β表达明显下调。说明口服M8/αPD-1胶囊可通过阻断PD-1通路引起抗肿瘤免疫反应。
图4 M8/αPD-1胶囊口服后可有效抑制肿瘤生长
图5 M8/αPD-1胶囊口服后可诱导体内抗肿瘤免疫应答
五．M8具有良好的体内生物相容性
连续口服Tween 80或SD后，血清内毒素及部分促炎细胞因子IL-4、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ含量显著升高，说明Tween 80和SD在持续口服后会引起潜在的肠道渗漏。M8组治疗的小鼠的指标无明显差异，且M8处理导致小鼠小肠中促炎细胞因子的上调也可忽略不计，说明反复口服M8不会对小鼠肠道造成明显损伤。因此，两性离子聚合物如M8的原位聚合被认为是一种有前途的技术，可以有效地口服蛋白质治疗药物。
图6 聚两性离子M8在体内具有良好的生物相容性和长期的生物安全性
【小结】
作者开发的基于聚两性离子的纳米系统可以有效地封装治疗性蛋白质，有效和安全的口服给药，而不破坏紧密连接。在未来的工作中，作者将进一步优化单体的组成和原位聚合反应条件，建立蛋白质口服载体库。特别是，规模化生产、体内生物降解性以及聚合步骤和最终产品的更好的质量控制，应该在未来的研究中得到解决。
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https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.2c08434
来源：高分子科学前沿
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